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學習重點 細菌內毒素試驗（BET）又稱 LAL 試驗，以鱟的變形細胞水性抽提液製成試劑，檢測對象為內毒素，不是活菌、病毒、效價或無菌性。 內毒素來自革蘭氏陰性菌，化學本質為脂多醣（LPS），可引起熱原性反應；USP 內毒素對照標準來源為大腸桿菌培養。 檢驗方法包括凝膠法、濁度法、呈色法。結果有爭議時，以凝膠法的限量試驗作最後判定；凝膠法本身包含限量試驗與定量試驗。 部分藥品會干擾反應，不能直接以原液檢驗。須分清楚「較適合使用 LAL」與「可不經稀釋使用 LAL」兩種問法。 依中華藥典第六版，注射用水內毒素含量每毫升不得超過 0.25 EU。 核心觀念 一、檢測對象：革蘭氏陰性菌內毒素 內毒素（endotoxin）是革蘭氏陰性菌細胞外膜的成分，其化學本質為脂多醣（lipopolysaccharide，LPS），其中 lipid A 是主要致熱部分。不可將其記成革蘭氏陽性菌的代謝產物。 內毒素進入人體可引起發燒等熱原性反應。細菌死亡或崩解後，內毒素仍可能存在，因此無菌不等於無內毒素。無菌試驗與 BET 的檢測目的不同，不能互相取代。 熱原是能引起發熱反應物質的統稱，內毒素是其中一類。LAL 主要用來檢測細菌內毒素，不能據此宣稱已排除所有種類的熱原。相較於以家兔觀察體溫變化的熱原試驗，LAL 是體外試驗，可減少動物使用。 內毒素也不等於類毒素（toxoid）。類毒素是外毒素經去毒處理後仍保有抗原性的物質；BET 的檢測對象仍是內毒素。 二、LAL 試劑來源與基本原理 LAL 為 Limulus amebocyte lysate 的縮寫。傳統試劑取自美洲鱟（Limulus polyphemus）血液中的變形細胞，以其水性抽提液製成。Amebocyte 與 amoebocyte 是常見的兩種拼法，均指變形細胞。 內毒素可啟動抽提液中的酵素連鎖反應，促使凝固蛋白原轉變為凝固蛋白，最後形成凝膠。因此，問到傳統 LAL 的基本反應時，應掌握「內毒素引發凝固、形成凝膠」。 在適當的試驗範圍內，內毒素含量增加，反應訊號也隨之增強，可用於內毒素含量的測定。不過，凝膠限量試驗主要判斷是否形成凝膠，不能單憑凝膠外觀直接讀出精確濃度。 USP BET 的內毒素對照標準來源為大腸桿菌（E. coli）培養。內毒素活性以內毒素單位（EU）表示；EU 是活性單位，不是細菌數量，也不是重量單位。 三、三種檢驗方法與判定原則 方法判讀依據考試重點 凝膠法是否形成堅實凝膠，倒轉試管時凝膠不流下包含限量試驗與定量試驗；結果有爭議時，以凝膠限量試驗作最後判定 濁度法凝固反應過程產生的濁度變化以光學方式測量，可採終點法或動態法 呈色法活化酵素作用於發色基質後產生的顏色顏色來自發色基質的反應，可採終點法或動態法 三法均可用來檢測內毒素，但「三種結果相異時以濁度法作最後判定」是錯誤敘述。另外，「形成凝膠」與「呈色法測量顏色」並不矛盾：前者是傳統凝固反應的核心，後者則利用活化酵素與另加發色基質的反應進行測量。 四、干擾因子與檢品適用性 檢品成分可能抑制或增強 LAL 反應，使結果偏低或偏高。因此，使用方法前應確認檢品適用性；當試驗條件改變而可能影響結果時，應進行干擾因子試驗。 若原液有干擾，可在最大有效稀釋倍數（MVD）容許範圍內稀釋，或採適當處理，並確認干擾已排除。不能無限制稀釋，否則可能因內毒素濃度過低而無法判斷是否符合限量。 考試分類代表製劑判斷重點 有效成分會干擾，不宜直接以原液檢驗Vancomycin HCl、Meperidine HCl、Oxacillin sodium、Sulfisoxazole、Promethazine HCl須先排除干擾，不能直接用原液結果判定 較適合使用 LAL 檢驗Heparin sodium與 meperidine、oxacillin、sulfisoxazole 比較時，選 heparin sodium 可不經稀釋檢驗的代表Pentobarbital sodium 注射液與 oxacillin、promethazine、vancomycin 比較時，選 pentobarbital sodium 未歸入上述有效成分干擾名單血漿蛋白、無菌注射用水不能與 vancomycin、meperidine 一併判成必然因有效成分而干擾 「不能直接使用」不等於「永遠不能使用」。干擾藥物經適當處理並確認方法適用後，仍可能使用 LAL 檢驗。上述分類用於掌握考試中的比較關係；實際製劑是否可直接檢驗，仍須由干擾試驗確認，不宜只憑藥名一概判定。 五、注射用水的內毒素限量 依中華藥典第六版，注射用水（Water for Injection）的內毒素含量每毫升不得超過 0.25 EU，即不大於 0.25 EU/mL。這是注射用水的規格，不可直接套用到所有注射劑。 常考陷阱 把檢測目的寫成效價、無菌性或熔封完整性：LAL 測的是內毒素，也不是直接測細菌、病毒或粉塵顆粒。 把來源寫成革蘭氏陽性菌：內毒素是革蘭氏陰性菌外膜的 LPS。「對 G（＋）內毒素具有足夠靈敏度」的說法錯誤。 把試劑來源寫成猴子、鱉、蟾蜍或家兔：LAL 試劑來源是鱟的變形細胞抽提液；家兔與傳統熱原試驗有關。 把凝膠反應寫成沉澱或吸光波長改變：傳統基本原理是形成凝膠；呈色法則另以發色基質產生顏色。 把最終判定方法寫成濁度法：有爭議時以凝膠限量試驗為準；凝膠法同時包含限量與定量試驗。 把干擾藥物理解成完全不能使用 LAL：關鍵是不可直接以有干擾的原液測定，須先處理並確認適用性。 混淆適合檢驗與不經稀釋：Heparin sodium 是較適合使用 LAL 的代表；Pentobarbital sodium 是不經稀釋檢驗的常考代表。 誤判正確敘述：內毒素增加可使反應增強、LAL 可減少動物使用、標準品源自大腸桿菌培養，均屬正確觀念。 記憶口訣 「鱟液測內毒，陰菌脂多醣」：記住試劑來源、檢測對象與內毒素本質。 「凝、濁、色；有爭凝膠決」：三種方法，有爭議時以凝膠限量試驗判定。 「萬、沒、歐、蘇、普，原液先別測」：依序對應 vancomycin、meperidine、oxacillin、sulfisoxazole、promethazine。 「注射用水四分之一」：限量為 0.25 EU/mL。