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學習重點 分離方法先看分子差異：離子交換看電荷、凝膠過濾看大小、親和層析看專一性結合、逆相層析看疏水性。 已有適當專一性配體時，純化已知分子通常以親和層析最專一且快速，也較容易得到高純度產物。 逆相層析與 HILIC 均歸為分配層析；HPLC 屬柱層析，薄層與濾紙層析屬平面層析。 逆相常用 C18 固定相，流動相極性較高；疏水性較強的成分通常較晚洗脫，適合分離大小與電荷相近、疏水性不同的胜肽。 掌握應用配對：mRNA 用 Poly T 管柱；氣相層析的火焰光度偵測器主要測硫、磷，熱離子選擇性偵測器可測氮、磷。 核心觀念 一、分離原理與方法選擇 層析利用樣品成分在固定相與流動相之間的分布或交互作用差異進行分離。不同方法的主要依據不同，不能只因為都能分離蛋白質，就認為其專一性與用途相同。 方法分離依據重要特性 離子交換層析淨電荷及電荷交互作用帶電分子與相反電荷的固定相結合，可改變鹽濃度或 pH 洗脫。 凝膠過濾／大小排阻層析分子大小、水動力體積大分子較少進入孔洞，先流出；小分子進入孔洞，較晚流出。 親和層析目標分子與配體的專一性結合固定相上的配體選擇性捕捉目標，適合純化已知分子。 逆相層析疏水性與分配差異固定相較非極性，流動相較極性；疏水性強者通常滯留較久。 薄層層析常利用吸附能力差異固定相塗於平板；常見矽膠薄層中，吸附較強者移動較慢。 離子交換主要利用帶電性，不是分子量、水溶解度或抗體親和力。蛋白質的淨電荷會隨 pH 改變，因此操作時須控制緩衝液條件。陰離子交換劑本身帶正電，結合陰離子；陽離子交換劑本身帶負電，結合陽離子。 凝膠過濾適合依大小分離蛋白質。其洗脫順序來自孔洞的排阻效果，而非大分子跑得比較快；若分子大小很接近，通常不適合作為主要區分方法。 親和層析可利用抗原與抗體、酵素與受質類似物、受體與配體等專一性作用。先捕捉目標、洗去雜質，再改變條件或加入競爭物洗脫。具備合適配體時，通常比離子交換、凝膠過濾或硫酸銨沉澱更能提高特定蛋白質的純度；硫酸銨沉澱本身並非層析法。 二、分配層析：逆相與 HILIC 分配層析利用成分在兩相間分配程度不同而分離；吸附層析則著重成分在固體表面的吸附差異。分類題中，逆相層析與親水性作用液相層析（HILIC）均歸入分配層析。 比較項目逆相層析HILIC 固定相疏水性、較非極性，常用 C18親水性、極性固定相 流動相相對固定相極性較高，常為水與甲醇或乙腈的混合液常以高比例乙腈搭配一定比例的水 主要保留趨勢疏水性較強者通常保留較久親水性較強者通常保留較久 HILIC 的重要機制是待測物在固定相表面的富水層與流動相之間分配；實際保留亦可能受到其他作用影響。作答時應掌握其分配型分類，不能只因固定相具有極性，就判成離子交換或親和層析。 逆相分析時，與固定相親和力越強，滯留時間通常越長。提高流動相中有機溶劑比例，常可促進疏水性成分洗脫。樣品須能溶於適當的進樣溶劑，並與流動相相容，並非必須不溶於流動相。 三、胜肽分離的判斷 若兩條胜肽的長度相同、側鏈電荷相近，卻有明顯疏水性差異，應優先考慮逆相液相層析或逆相 HPLC，而非僅依分子大小選凝膠過濾。 Pro-Ser-Val-Ala-Ile 與 Asn-Ala-Thr-Ser-Pro：前者含較多疏水性殘基，後者含較多極性殘基，適合利用逆相層析區分。 Ala-Phe-Ser 與 Ala-Ala-Ser：Phe 的芳香族側鏈使前者疏水性較強，在一般逆相條件下通常較晚洗脫。 上述胜肽都沒有明顯帶電側鏈差異，離子交換較缺乏直接的區分優勢；也不能在未提供專一性配體時，直接認定親和層析最適合。 四、柱層析與平面層析 HPLC 屬於柱層析，流動相由高壓泵推送通過管柱。HPLC 並非單一分離機制，可搭配逆相、離子交換、大小排阻等模式。 薄層層析與濾紙層析屬平面層析。薄層層析的固定相鋪在平板上，常用於脂質成分分析；濾紙層析則以濾紙為支持材料。 五、氣相層析與偵測器 氣相層析以氣體作為流動相，待測物須具有適當揮發性與熱穩定性。氣液相層析利用成分在氣態流動相與液態固定相間的分配差異分離，保留亦受到揮發性影響；氣固相層析則以固體表面吸附為主。 偵測器判斷重點 火焰光度偵測器（FPD）主要選擇性偵測硫、磷，不適合作為一般含氮化合物的偵測器。 熱離子選擇性偵測器（TSD）對氮、磷具有選擇性，也稱氮磷偵測器。 電解傳導度偵測器將成分反應轉化後測量電導度；適當操作模式可分析含氮、硫或鹵素化合物。 質譜儀（MS）使待測物離子化，依質荷比分析，可用於含氮化合物。 六、mRNA 捕捉與脂質分析 真核細胞成熟 mRNA 通常具有 3′ 端 poly(A) 尾，可與固定相上的 oligo(dT)，即題目所稱的 Poly T 管柱互補配對，達到親和性捕捉。辨認關鍵是 A 與 T 互補，因此不是選 Poly A、Poly C 或 Poly G。 脂質可用薄層層析、氣液相層析及 HPLC分析。氣相分析常須適當前處理，例如將脂肪酸轉為較適合揮發的衍生物，並非所有脂質均能直接進樣。 一般總脂質萃取常使用氯仿／甲醇等有機溶劑系統；不能把甲醇／水當成普遍適用的總脂質萃取配方。甲醇／水可作為某些液相層析的流動相，應區分萃取溶劑與層析流動相的用途。 常考陷阱 「凝膠過濾依電荷分離、小分子先流出」：皆錯；看大小，大分子先出。 「親和層析只要知道名稱就一定能用」：須有適當專一性配體；具備此條件時，純化已知分子通常最專一且快速。 「逆相固定相較極性、脂溶性高者先出」：方向顛倒；C18 疏水，疏水性強者通常較晚出。 「逆相屬吸附型，HILIC 屬離子交換」：分類題均應掌握分配層析。 「HPLC 是平面層析或只代表逆相」：HPLC 是柱層析，可採不同分離機制。 「火焰光度可測一般含氮物」：應區分 FPD 的硫、磷與 TSD 的氮、磷。 「mRNA 有 poly(A)，所以選 Poly A」：捕捉靠互補配對，應選 Poly T。 記憶口訣 「電荷離子、大小凝膠、專一親和、疏水逆相；大先小後，疏水晚走；mRNA 尾巴 A，管柱配 T。」 「火光硫磷，熱離氮磷；HPLC 走柱，薄層濾紙走平面。」