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學習重點 胜肽鍵形成：兩個胺基酸經脫水縮合形成雙肽，脫去一分子水；n 個胺基酸形成一條線性多胜肽時，形成 n－1 個胜肽鍵，並脫去 n－1 分子水。 末端基團與分子量：一般未修飾的線性多胜肽保留一個 N 端游離 α-胺基及一個 C 端游離 α-羧基；分子量須由胺基酸分子量總和扣除脫去的水。 雙硫鍵與胱胺酸：兩個半胱胺酸的側鏈硫氫基經氧化形成雙硫鍵；胱胺酸是兩個半胱胺酸以雙硫鍵連接的產物。 雙硫鍵的破壞：β-巰基乙醇及 DTT 可還原雙硫鍵，形成游離硫氫基；過甲酸則以氧化方式裂解雙硫鍵。 雙縮脲法：在鹼性環境中，銅離子與胜肽鍵參與形成紫色錯合物；三胜肽具有兩個胜肽鍵，可呈陽性反應。 核心觀念 一、脫水縮合與胜肽鍵形成 一個胺基酸的 α-羧基與另一個胺基酸的 α-胺基結合，淨反應為脫去一分子水（H₂O），形成一個胜肽鍵（peptide bond），結構為－CO－NH－。因此，兩個胺基酸形成雙肽時，脫去的不是二氧化碳、氨或一氧化碳。 胜肽鍵屬於共價鍵，負責連接胺基酸、構成多胜肽主鏈。對一條未環化的線性多胜肽而言，每增加一個胺基酸殘基，就多形成一個胜肽鍵。 組成胜肽鍵數脫去水分子數 雙肽：2 個胺基酸11 三胜肽：3 個胺基酸22 10 個胺基酸的線性多胜肽99 n 個胺基酸的線性多胜肽n－1n－1 二、胜肽分子量與游離 α-羧基 計算由游離胺基酸形成之線性胜肽的分子量時，必須扣除脫去的水；每分子水的分子量以18計算： 胜肽分子量＝各胺基酸分子量總和－18×（胺基酸數－1）。 例如 alanine（Ala）、glycine（Gly）、serine（Ser）的分子量分別為 89、75、105。形成 Ala－Gly－Ser 時有兩個胜肽鍵，須扣除兩分子水，因此分子量為89＋75＋105－2×18＝233。269 是尚未扣水的總和；只扣一分子水也不正確。 形成胜肽鍵後，鏈內胺基酸原有的 α-羧基已轉為醯胺結構，不再是游離 α-羧基。一般未環化、末端未修飾的單條多胜肽，只有C 端保留一個游離 α-羧基，N 端則保留一個游離 α-胺基。因此，10 個胺基酸組成的線性多胜肽有 9 個胜肽鍵，但只有 1 個游離 α-羧基。 天冬胺酸、麩胺酸的側鏈也可帶有羧基，但側鏈羧基不是 α-羧基，不可混入末端 α-羧基的計數。 三、半胱胺酸、胱胺酸與雙硫鍵 半胱胺酸（cysteine，Cys）的側鏈具有硫氫基，又稱硫醇基或巰基（－SH）。兩個半胱胺酸的硫氫基經氧化，可形成雙硫鍵（－S－S－）： 2 R－SH → R－S－S－R＋2H⁺＋2e⁻。 兩個游離半胱胺酸以雙硫鍵相連的產物稱為胱胺酸（cystine）。它由兩個半胱胺酸形成，連接方式是雙硫鍵，形成方向是氧化；還原胱胺酸則可得到兩分子半胱胺酸。 蛋白質中的雙硫鍵可形成於同一條多胜肽鏈內，也可連接不同多胜肽鏈或不同蛋白質分子，協助穩定蛋白質結構。它屬於側鏈間的共價交聯，與構成主鏈的胜肽鍵不同。 甲硫胺酸（methionine，Met）雖然含硫，但側鏈為硫醚，沒有可供一般雙硫鍵形成的游離－SH。絲胺酸（Ser）的側鏈是羥基，丙胺酸（Ala）的側鏈是甲基，也不負責形成雙硫鍵。 判斷蛋白質內哪些側鏈較易形成共價交聯時，應優先辨認Cys－Cys。一般情況下，Ser－Glu、Asp－Asp 或 Ser－Ser 都不會像兩個 Cys 一樣形成雙硫鍵。 四、雙硫鍵的還原與氧化裂解 試劑作用方式重要結果 β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）還原雙硫鍵形成游離硫氫基 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）還原雙硫鍵形成游離硫氫基 過甲酸（performic acid）氧化裂解雙硫鍵硫進一步氧化，形成磺酸基 甲醇（methanol）不是雙硫鍵裂解試劑不能用來將雙硫鍵還原成－SH 必須分清「破壞雙硫鍵」與「還原成游離硫氫基」：過甲酸能破壞雙硫鍵，但不會得到與還原劑相同的游離－SH 產物。β-巰基乙醇處理游離胱胺酸，可得到兩分子半胱胺酸；處理蛋白質時，則使參與雙硫鍵的半胱胺酸殘基恢復－SH，不代表將它們從主鏈切下。 重碳酸銨、氯化鈉與溴化乙錠均不是用來將蛋白質雙硫鍵還原成游離硫氫基的試劑。蛋白質變性或沉澱，也不等於雙硫鍵已被切斷。 五、雙縮脲法偵測胜肽鍵 雙縮脲法，又稱雙脲法（Biuret method），是常用的蛋白質檢測方法。反應需要鹼性環境與二價銅離子（Cu²⁺）；銅離子與胜肽鍵的氮原子配位，形成典型的紫色錯合物。 典型陽性反應通常需要分子中具有至少兩個胜肽鍵，因此三胜肽已可反應；雙肽只有一個胜肽鍵，通常不呈典型陽性。游離胺基酸沒有胜肽鍵，也不呈典型的雙縮脲紫色反應。 此法的判讀重點是胜肽鍵所提供的配位環境，不能將反應原理寫成「銅離子與游離胺基酸形成紫色複合物」。即使游離胺基酸可與金屬離子配位，也不等同於典型雙縮脲反應。 常考陷阱 「雙肽形成時脫去 NH₃、CO₂ 或 CO」：應為 H₂O；一個胜肽鍵對應脫去一分子水。 「三胜肽只扣一分子水」：三個胺基酸形成兩個胜肽鍵，分子量須扣除 36。 「10 個胺基酸就有 10 個游離 α-羧基」：單條一般線性多胜肽只有 C 端的一個；9 是胜肽鍵數。 「胱胺酸由三個半胱胺酸形成，或以胜肽鍵連接」：應為兩個半胱胺酸以雙硫鍵連接。 「胱胺酸是半胱胺酸還原後的產物」：方向相反；氧化形成雙硫鍵，還原恢復硫氫基。 「含硫胺基酸都能形成雙硫鍵」：關鍵是側鏈有無游離－SH；應選半胱胺酸。 「過甲酸與 DTT 都還原出－SH」：兩者都可破壞雙硫鍵，但過甲酸採氧化裂解，DTT 採還原。 「甲醇可切斷雙硫鍵」：甲醇不是雙硫鍵裂解試劑；不能把變性與共價鍵斷裂混為一談。 「雙縮脲偵測游離胺基酸，產物呈紅、黃或綠色」：應辨認鹼性、銅離子、至少兩個胜肽鍵及紫色產物。 記憶口訣 「一鍵脫一水，三肽扣三六；線鏈尾一羧，雙縮銅鹼紫；半胱氧化連，還原雙硫開。」