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學習重點 掌握分離依據：等電焦集法依等電點分離；SDS-PAGE 主要依分子量分離；常用二維電泳先做等電焦集，再做 SDS-PAGE。 理解 SDS 與電泳條件：SDS 使蛋白質變性並帶大量負電，聚丙烯醯胺膠提供分子篩效應，小分子通常向正極移動得較快、較遠。 熟悉分子量估算：平均每個胺基酸殘基約為 110 Da；編碼區每三個鹼基約對應一個胺基酸。 分清染色目標：一般蛋白質常用考馬斯亮藍、醯胺黑或麗春紅 S；脂蛋白可用油紅 O、Fat Red 7B 或蘇丹黑 B。 依蛋白含量選擇靈敏度：銀染適合微量蛋白，尤其是未濃縮腦脊髓液等低蛋白含量樣品。 核心觀念 一、等電焦集法：依等電點分離 等電焦集法（isoelectric focusing，IEF）利用蛋白質間的等電點（pI）差異進行分離。介質中須建立 pH 梯度；蛋白質的淨電荷會隨所在位置的 pH 改變。 pH 低於 pI：蛋白質淨帶正電，朝負極移動。 pH 高於 pI：蛋白質淨帶負電，朝正極移動。 pH 等於 pI：蛋白質淨電荷為零，停止淨遷移，聚集於該位置。 蛋白質若偏離自身 pI 的位置，便會重新帶電並移回，因此形成集中的蛋白帶。IEF 的直接分離依據是等電點，不是分子量，也不是單純計算陰離子或陽離子含量。若比較不同分離技術，膠體過濾主要依分子大小；IEF 則利用蛋白質帶電性質及 pI 的差異。 二、二維電泳：先等電點，後分子量 比較項目第一維第二維 常用方法等電焦集法（IEF）SDS-PAGE 分離依據等電點分子量 關鍵條件具有 pH 梯度SDS 處理與膠體分子篩效應 常用蛋白質二維電泳先以 IEF 分離，再沿另一方向進行 SDS-PAGE。因此，蛋白質斑點的位置由等電點與分子量共同決定。第一維不是直接依胺基酸序列分離；第二維也不以建立 pH 梯度作為分離原理。 三、SDS-PAGE：帶負電的小蛋白跑得較遠 SDS 是陰離子界面活性劑，可破壞維持蛋白質構形的非共價作用，使大多數蛋白質變性、伸展為近似直線形或桿狀，並帶大量負電。由於各蛋白質結合 SDS 後的電荷／質量比趨於一致，天然電荷與原有形狀的影響降低，遷移差異主要反映分子量。 在聚丙烯醯胺膠中，蛋白質朝正極（陽極）移動；通常分子量越小，越容易通過膠體孔洞，移動越快、距離越遠。比較白蛋白、微球蛋白（BMG）、運鐵蛋白與 C-反應蛋白時，BMG 分子量最小，因而最接近正極。不可直接套用未加 SDS 時血漿蛋白的天然電泳順序。 SDS 並不負責還原雙硫鍵。若要切斷雙硫鍵，須加入DTT 或 β-巰基乙醇等還原劑。多次單元蛋白經還原處理後，SDS-PAGE 所顯示的通常是各多肽鏈的分子量，而非完整複合體的總分子量。 四、膠體、緩衝液與結果判讀 聚丙烯醯胺膠（polyacrylamide gel）是 SDS-PAGE 的標準介質，也是西方墨點法進行蛋白質電泳分離時最適合的膠體。西方墨點法先將蛋白質電泳分離，再轉漬至膜上，以抗體偵測目標蛋白。 膠體濃度與交聯程度會影響孔洞大小；較高濃度的膠通常具有較小孔洞，適合分離較小蛋白質。常用電泳緩衝系統為Tris–甘胺酸（glycine），因此甘胺酸是常見的蛋白質電泳緩衝液成分。溴酚藍（bromophenol blue）則主要作為追蹤電泳前緣的示蹤染料。 膠體電泳可由條帶數量及分布評估純度，並與已知分子量的標準蛋白比較，估算分子量。在適當分離範圍內，分子量的對數與相對遷移率約呈線性關係。不過，不同蛋白可能共同遷移，微量雜質也可能未被染出，因此單一條帶不代表絕對純化。 五、由胺基酸數與編碼區長度估算分子量 平均每個胺基酸殘基約為 110 Da，且 1 kDa＝1,000 Da。估算公式為： 蛋白質分子量（kDa）≈ 胺基酸數 × 110 ÷ 1,000。153 個胺基酸：約為 153 × 110＝16,830 Da＝16.8 kDa。 由 DNA 編碼區估算時，先利用每三個鹼基形成一個密碼子，換算胺基酸數。600 bp 的編碼區約對應 200 個胺基酸，故分子量約為 200 × 110＝22,000 Da＝22 kDa。雙股 DNA 的互補股不會使胺基酸數加倍；終止密碼子不編碼胺基酸，但不影響此處的近似估算。 六、蛋白質與脂蛋白的染色選擇 染劑用途與辨識重點 考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）SDS-PAGE 後最常用的蛋白質染劑，蛋白帶呈藍色；亦可用於血清蛋白染色。 醯胺黑（Amido Black）可用於血清及其他蛋白質染色，蛋白帶呈藍黑色。 麗春紅 S（Ponceau S）可將血清蛋白帶染成紅色，也常用於轉漬膜上的蛋白質檢查。 銀染／硝酸銀（Silver nitrate）蛋白質染色靈敏度高，適合未濃縮腦脊髓液中的微量蛋白。 油紅 O（Oil Red O）、Fat Red 7B、蘇丹黑 B（Sudan Black B）屬脂質染劑，可用於顯示脂蛋白的脂質部分；不適合一般總蛋白染色。 溴乙錠（Ethidium bromide）主要用於核酸染色，不是一般蛋白質染劑。 溴酚藍（Bromophenol blue）主要追蹤電泳前緣，不能當作常規蛋白帶染色劑。 選染劑時先辨認目標是蛋白質或脂質，再考慮含量。一般血清蛋白可用醯胺黑、考馬斯亮藍或麗春紅 S；脂蛋白電泳可選油紅 O、Fat Red 7B 等脂質染劑。未濃縮腦脊髓液的蛋白含量低，宜選高靈敏度銀染。一般銀染的靈敏度高於傳統考馬斯亮藍染色，但實際偵測能力仍依染色方法與背景而異。 常考陷阱 「IEF 依分子量分離」：錯，應看等電點；SDS-PAGE 才主要看分子量。 「二維電泳第一維是 SDS-PAGE」：錯，常用順序是先 IEF，再 SDS-PAGE；pH 梯度是第一維的關鍵。 「SDS 使蛋白質帶正電」或「大蛋白跑得快」：皆錯。SDS 使蛋白質帶負電，小蛋白通常向正極跑得較遠。 「氧化劑打開雙硫鍵」：錯，應使用還原劑；也不可把還原雙硫鍵的功能歸給 SDS。 「600 bp 就有 600 個胺基酸」：錯，須先除以三，再乘每個殘基約 110 Da。 「藍色染料都能作為常用蛋白染劑」：錯。常用者是考馬斯亮藍，不能因名稱有 blue 就選 Trypan blue、Methylene blue 或 Brilliant cresyl blue。 「紅色蛋白帶選油紅 O」：錯。血清蛋白紅色染帶選麗春紅 S；油紅 O 主要染脂質。 「蘇丹黑 B 不適合任何電泳染色」：錯。它可染脂蛋白的脂質部分，但不適合一般血清或體液總蛋白染色。 「未濃縮腦脊髓液直接套用一般染劑」：應先考慮蛋白量低，選高靈敏度銀染。 記憶口訣 「一等電、二分量；SDS 負，小跑快。三鹼一胺、殘基一一零；考馬藍、麗春紅，油紅染脂、微量用銀。」