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學習重點 依檢測標的分清楚技術層級：cDNA微陣列測量的是基因表現量（mRNA）；FISH觀察特定核酸序列在細胞或染色體上的位置與數量；傳統染色體核型分析觀察整體染色體的數目與結構；定序與等位基因專一性方法才能直接判讀DNA序列與基因型。 FISH偵測染色體層級異常，不偵測點突變：基因融合、轉位、重排、放大、大片段缺失及染色體數目異常可用FISH偵測；點突變（如JAK2 V617F）需用其他分子方法。 FISH是輔助工具，不能取代傳統染色體分析做初次診斷：FISH只能回答探針設計的問題，無法全面檢視所有染色體。 掌握傳統核型分析原理：秋水仙素抑制紡錘絲形成，使細胞停留在有絲分裂中期（metaphase）。 熟記染色體臂命名：以著絲點區分，短臂為p，長臂為q。 核心觀念 一、cDNA微陣列：偵測基因表現，不直接鑑定基因型 cDNA微陣列是將組織或細胞中的RNA反轉錄成cDNA並加以標記，再與固定在晶片上的已知基因探針雜交，依螢光訊號強弱估算各基因的相對表現量。它適合比較不同狀態下哪些基因表現增加或減少，可用於疾病的分子分類、預後與治療反應評估。 此技術的核心限制是：偵測的是mRNA的相對豐度，而不是直接閱讀DNA的鹼基序列。因此無法直接鑑別單核苷酸變異、插入或缺失等序列變化，也不能可靠區分各種等位基因型。不同基因型的mRNA表現量可能相同或差異極小，表現訊號不能當作基因型判讀依據。 檢測方法主要偵測標的能否鑑別已知基因型 cDNA微陣列mRNA／cDNA雜交訊號不能，只反映基因表現量 定序（Sequencing）核酸鹼基序列可以，直接讀出序列變異 等位基因專一性PCR（Allele-specific PCR）以專一性引子增幅特定等位基因可以，針對已知變異 等位基因專一性寡核苷酸雜交（ASO hybridization）與特定等位基因完全互補的寡核苷酸探針可以，針對已知變異 以血庫學的ABO亞型為例，國人B3表現型由DNA序列上的特定變異所造成，要鑑別其所有已知基因型，必須使用能直接辨識DNA序列的方法（ASO雜交、等位基因專一性PCR或定序）；cDNA微陣列只看表現量，無法完成這種基因型鑑別。 二、FISH：以核苷酸互補配對定位核酸 螢光原位雜交（FISH）是利用帶螢光標記的探針，依核苷酸互補配對（complementarity）原理，與細胞、染色體或組織切片中的目標序列雜交，再以螢光顯微鏡觀察訊號的位置與數目，藉此判斷特定基因的位置、是否重排，以及特定區域的拷貝數變化。 FISH的重要特性： 可使用未分裂的間期細胞（interphase cell）：不必培養到分裂期，適用於分裂指數低、培養失敗或需要快速結果的檢體；當然也可用於中期染色體。 可分析DNA與RNA：探針可與DNA或RNA的互補序列雜交，用來定位DNA與RNA片段的所在。 屬於靶向檢查：只能偵測探針所針對的區域，看不到探針範圍以外的其他異常。 FISH可偵測的異常判讀方式例子 染色體轉位造成的基因融合兩種顏色的探針訊號靠近或融合t(9;22)形成的BCR::ABL1 大片段缺失造成的基因融合缺失區域訊號消失，兩端基因訊號接合4q12缺失形成的FIP1L1::PDGFRA 基因重排斷裂分離（break-apart）探針訊號分開特定基因的重排 基因放大同一探針訊號數目增加或成簇特定基因拷貝數增加 染色體數目異常著絲點探針訊號數目增減trisomy 8出現三個訊號 FISH無法偵測點突變：點突變只是單一鹼基的改變，FISH探針長度可達數萬至數十萬鹼基，單一鹼基不同仍能雜交，螢光訊號的位置與數目不會改變。例如JAK2 V617F屬點突變，須以等位基因專一性PCR、定序等分子方法偵測。 FISH不能取代傳統染色體分析做初次診斷：傳統核型分析可一次全面檢視所有染色體的數目與結構，發現未預期的異常；FISH只回答探針設計的問題。初次診斷時應以傳統染色體分析為基礎，FISH作為補充、確認或追蹤的工具，兩者互補。 三、傳統染色體核型分析與秋水仙素 傳統染色體核型分析須先培養細胞使其分裂，再加入秋水仙素（colchicine）或其衍生物colcemid。秋水仙素與微管蛋白結合，抑制紡錘絲形成，使染色體無法分離進入後期，細胞因此停滯並累積在有絲分裂中期（metaphase）。 中期染色體凝縮程度高、形態最清楚，便於計數、配對、辨識著絲點位置與分帶型態，分析數目與結構異常。 時期特點是否為核型分析的觀察時期 間期（interphase）染色質鬆散，看不到個別染色體否（但FISH可用） 前期（prophase）染色體開始凝縮否 中期（metaphase）染色體最凝縮、排列於赤道板是，秋水仙素使細胞停在此期 後期（anaphase）姊妹染色分體分離否，秋水仙素阻止細胞進入此期 四、染色體長短臂命名 染色體依著絲點（centromere）分為兩臂：短臂以p表示（取自法文petit，意為小），長臂以q表示（字母順序接在p之後）。例如「9q34」指第9號染色體長臂，「5p」指第5號染色體短臂。染色體命名中沒有以r或s代表長短臂。 常考陷阱 「FISH可以取代傳統染色體分析，用於疾病的初次診斷」：錯。FISH只偵測探針針對的區域，傳統核型分析才能全面檢視，兩者互補。 「FISH必須使用分裂中期細胞」：錯。FISH可使用未分裂的間期細胞，這正是它的優勢之一。 「FISH只能偵測DNA」：錯。FISH可分析DNA與RNA片段的所在。 「FISH可偵測點突變（如JAK2 V617F）」：錯。點突變不會改變訊號的位置與數目，FISH無法偵測。 「大片段缺失造成的融合基因（如FIP1L1::PDGFRA）不能用FISH」：錯。大片段缺失可由訊號消失判讀，可用FISH偵測；轉位融合（BCR::ABL1）與數目異常（trisomy 8）也都可以。 「cDNA微陣列可鑑別所有已知基因型」：錯。它偵測mRNA表現量，不能辨識DNA序列變異；ASO雜交、等位基因專一性PCR與定序才可以。題目問「無法鑑別基因型」的方法時，選cDNA微陣列。 秋水仙素的作用時期選成間期、前期或後期：錯。秋水仙素抑制紡錘絲，使細胞停在中期。 把p與q弄反，或被r、s混淆：短臂p、長臂q，沒有r或s臂。 記憶口訣 「微陣列看表現，FISH看位置；點突變FISH看不見，初診仍靠核型片；秋水仙停中期，p短q長要記清。」 判斷檢測層級時先問：要看的是表現量（微陣列）、染色體上的位置與數量（FISH）、全部染色體（核型分析），還是單一鹼基序列（定序、等位基因專一性方法）？